基因治疗对ALI治疗效果的影响

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基因治疗（基因治疗）是指通过载体将外源性正常基因导入靶细胞，以达到治疗目的，从而纠正或弥补基因缺陷和异常引起的疾病。即通过基因转移技术将外源性基因插入患者适当的受体细胞，使外源性基因产生的产物能够治疗某些疾病。基因被载入细胞表达的载体包括病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体分为腺病毒。与腺病毒有关的病毒。反向记录病毒载体等；非病毒载体包括脂质体.磷酸钙.基因枪等。腺病毒是基因治疗的主要载体，并在所有基因治疗研究中占28%[1,2]。急性肺损伤(ALI)是一种常见的危重疾病，严重威胁生命安全，其死亡率在我国高达60%~70%。传统的ALI治疗方案仅限于挽救生命和疾病，因此，尝试基因治疗等新治疗方法已成为当前研究的热点。然而，以其为载体的基因治疗对ALI治疗效果的影响对于腺病毒本身的炎症作用是罕见的。本研究观察了腺病毒感染和炎症作用对小鼠ALI基因治疗效果的影响和意义，并建立了小鼠ALI疾病模型。

1材料和方法。

1.1物质动物：本研究所研究使用的小鼠均经美国宾夕法尼亚大学动物部批准。小鼠的随机性分为4组:(1)吸氧前对照组(Con组)15组;(2)腺病毒治疗组(AdLAZ组)标记的20只;(3)磷酸盐缓冲液(PBS组)治疗组(PBS组)20只;(4)无治疗组(无治疗组)20只。

方法1.2。

1.2.1在100%O2暴露前两天，通过鼻道的治疗方法将腺病毒浓缩制剂的缓冲剂根据小鼠的体重调整每只小鼠50μL，并将总容量分为四次，当小鼠在麻醉状态下处于垂直位置时，通过鼻腔吸入。

1.2.2高氧性肺损伤模型的每一组小鼠在随机取样后，将其暴露在100%O2灌注的氧气舱中，同时制作高氧性肺损伤动物模型。氧气舱内的氧流量为6~8L/min，舱内的氧交换频率为6~7次/h，CO2为0.2%，湿度约为45%，日间交替，夜间交替，约12小时。分别收集肺组织和肺泡灌洗液等标本，用于检测100%O2吸入后的24.48和72小时。

1.2.3标本在高氧吸入前后的24.48和72h进行收集和处理，应用苯巴比妥(50mg/kg)腹部深麻醉小鼠，暴露小鼠主气管并行气管插管和机械通气。沿胸腹中线切开皮肤和腹部皮下组织，暴露腹部器官和腹部主动脉。为了减少肺部血流，分隔腹部主动脉放血，然后打开胸部，分离心脏和肺旁结缔组织，通过右心室穿刺。肺泡灌注液通过右心室灌注肺组织，水压为20~30cmH2O(1cmH2O=0.098kpa)，直至肺组织血液清洗干净。分离出来的肺组织在液氮中迅速冷藏，并将肺标本保存在-80℃的冰箱中备用。此外，在机械通气后和肺泡灌注前，用注射器对肺泡进行3次灌洗，并收集支气管-肺泡灌洗液。肺组织通过4%的主气管进入肺泡中的甲醛溶液，以备用于肺组织的细胞化学染色。

1.2.4X-gal染色β-半乳糖酶染色[4]可提供LacZDNA集成到肺上皮细胞DNA后的蛋白表达分布的影像学分析。在X-gal复合试剂（K4Fe（CN）6-3H2O，K3Fe（CN）6，2mgMGCL2an0.5mg/mlofeX-gal）中，新鲜的整体肺组织固定并完全漂洗后，可在X-gal复合试剂（K4Fe（CNe）6-3H2O，K3Fe（CNe）6和2mgMGCL2and0.5mg/mlofex-gal）中过夜孵化。第二天，在PBS漂洗后，观察肺组织X-gal颜色后的蓝色深度和范围，并记录下来。染色后的整体肺组织通过10%.20%和30%蔗糖溶液依次再次固定。然后，肺组织被埋葬在OCT复合物中，并在液氮中快速冷冻。沿着气管纵轴将肺组织切成厚度为10米的片段；核红试剂复合染色后，可在荧光显微镜下观察（200倍）。

1.2.5β-半乳糖酶活性测定[5]10mg肺组织在0.25mol/LTris-HCl均匀浆缓冲液中快速均匀浆。200μl邻硝基酚半乳糖反应底化合物和900μl含有-巯基乙醇的裂解试剂混合均匀后，加入100μl肺组织均匀浆，在37℃下孵化，产生O-硝基吡喃（ONP）。该产品可在波长420nm的分光光度计中测定。同时，肺组织均匀浆中的蛋白质浓度是通过牛马球蛋白作为标准物来确定的。β-半乳糖酶的活性表达是单位/毫克蛋白(U/mg)。

1.2.6通过苯巴比妥腹腔深麻醉，肺干/湿重比测定小鼠接触气管并行气管插管和机械通气。打开胸部后，肺组织将直接保留。在肺组织外液体迅速吸收后，称重记录为肺湿重，并送至干燥盒烘干。大约72小时后，记录为肺干重。

1.2.7通过气管插管收集支气管-肺泡灌洗液，测量小鼠肺泡洗液中支气管-肺泡洗液中支气管-肺泡洗液中支气管洗液中支气管洗液中支气管洗液中支气管洗液中支气管洗液中支气管洗液中支气管洗液中支气管洗液中支气管洗液。

1.3统计分析数据表达方式为(x±s)。显着差异分析采用美国Sigmastat统计分析软件，两组之间显着差异统计分析采用T检验；多组之间显着差异统计分析采用WayANOVA检验。

　　2结果

2.以腺病毒为载体的LacZDNA在肺内转染的分布和表达活性小鼠在100%O2吸入前2天经鼻吸入装载LacZDNA的腺病毒，并在100%O2吸入开始时采集标本并应用X-gal染色，以了解LacZ基因在肺内转染的分布情况；同时，在100%O2吸入开始时和24.48小时和72小时分别采集肺组织，以测量LacZDNA表达蛋白β-半乳糖酶的活性。X-gal染色结果显示，LACZDNA可以在全肺和肺各级支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的广泛转染和分布如蓝色颗粒(图1A.B)；在高氧吸入24.48和72h之前，可以测量LACZDNA的蛋白表达产物β-gal的活性，同时，在高氧吸入72h之后，该蛋白表达仍然保持在高氧吸入前的2倍以上(表1)。表1β-半乳糖酶的活性。

2.2腺病毒载体在高氧性肺损伤基因治疗中的炎症作用，随着高氧暴露时间的延长，肺干/湿重比呈时间-依赖性增加。100%O2吸入48小时后，与无治疗组小鼠相比，Adlacz组小鼠的肺干/湿重比有明显差异；然而，在继续吸入24小时O2之后，尽管Adlacz组的肺干/湿重比仍然保持在较高水平，但与其他两个对照组相比没有显著差异（图2）。与高氧吸入24小时和48小时的非治疗组相比，Adlacz组小鼠支气管-肺泡灌洗液中的蛋白质浓度差异显著；在高氧吸入72小时后，每组小鼠支气管-肺泡灌洗液中的蛋白质浓度基本保持相似水平。