MTT检测在ELISA中的应用

来源:华文易迅 时间:2023-07-31 09:00:02

该文就红花提取物对氧化低密度脂蛋白引起的心肌微血管内皮细胞损伤的作用机制作一探讨，并对其作用机理作一探讨。

1信息和方法。

1.1试验性药品

1.1.1红花提取物工艺：取新疆红花200g，加水2500mL，加热至煮沸，浸出1.0h，过滤，最后将滤液浓缩至每毫升3.338g生药[1]。

1.2实验性动物：5~7天生下大鼠乳鼠。

1.3试验试剂：噻唑蓝(MTT,sigma,SP1080)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，SOD(SOD)、DMSO(DMSO)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、乳酸脱氢酶、过氧化物酶(GSH-Px)谷胱甘肽脱氢酶、一氧化氮（NO）和黄嘌呤氧化酶（XOD）测定试剂盒。

1.4试验仪器：超净台面、MCO-15AC型CO2培养盒、MK型倒置显微镜、H2S-H恒温浴盆、LDZ4-0.8离心机、550型酶联免疫检测仪。

1.5红花水提取物对大鼠大鼠心肌微血管内皮细胞损伤的影响。

1.5.1培养大鼠原代心肌微血管内皮细胞(rCMEC)：首次用原代培养，rCMEC鉴定rCMEC，再传代培养，第3代rCMEC用于实验[2]。

1.5.2实验分组：将内皮细胞接种在96孔板上，每孔0.1mL,1.5×105个/mL。在24h细胞贴壁之后，对照组：①空白对照组：无血清培养基100μL每孔增加100μL；②模型对照组：在无血清培养基100μg.mL-1的ox-LDL作用24h；③红花水提取物500μg·mL-1组，每孔加入100μg.mL-1组，在造模前24h，在100μg·mL-1组中加入100μg·mL-1，在造模前24h加入100μL，在此条件下，加入含ox-LDL的无血清培养液，24h[3]。

1.6形态观测。

1.7指标检测和计算：采用MTT法检测活细胞数量与吸光度(A值)成正比，故以A值表示细胞存活率，抑制率=[1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)]×100%。MTT检测在ELISA中[4]用于ELISA。

1.8资料分析：以平均值±标准差的形式表示结果，并用方差分析(ANOVA)作多组比较，以P.0.05计算差异有显著性。

2结果

形态学观察：倒置显微镜下观察到：正常对照组和大、中剂量组细胞形态相似，无明显改变；模型组细胞皱缩，呈空泡状。MTT染色后，模型组大多数细胞没有着色，有少量细胞出现紫色结晶，随各给药组红花水提取物浓度的增加而增加。

2.2对内皮细胞存活的影响：红花水提取物500微克？mL-1,100微克？mL-1,20μ？mL-1对ox-LDL所致内皮细胞损伤有明显抑制作用，细胞存活率显著提高。

2.3不同浓度的红花提取物均有良好的抑菌作用，并能降低NO、SOD、GSH-Px及NOS含量，并能降低细胞上清液中LDH、XOD和MDA含量。

3讨论

结果表明，生物体内低密度氧化修饰呈现出一种自由基链反应过程。用红花水提取物提高血管内皮细胞的SOD活性及过氧化物酶活性，从而缓解氧自由基损伤。红花水提取物可有效地降低ox-LDL对内皮细胞的氧化损伤，并能抑制MDA和乳酸脱氢酶(LDH)的产生，提高NO、SOD、GSH-Px及NOS活性，保护内皮细胞，抑制其氧化损伤。