Mr38000蛋白片段扩增和序列测定

来源:华文易迅 时间:2023-06-05 09:00:03

2.1Mr38000蛋白片段的扩增和序列测定，经过30次PCR扩增后，可以得到相当于预期长度的片断。DNA被回收后插入pGEM-T-Easy载体中，测序结果表明，该序列与在GeBank数据库中发现的Mr38000序列完全一致。

M:DNAmarkerDL2000;1:PCR产物基因；

Mr38000蛋白基因产物琼脂糖凝胶电泳(10g/L)是一种PCR方法。

2.2pQE-80L通过BamHI和EcoRⅠ双酶切后，结合Mr38000基因目的片段进行连接反应，得到了转化状态E.coliDH5α。分离的克隆子经酶切法鉴定，切出了约1151bp大小片段的克隆子阳性(图2)，命名为pQE-80L-Mr38000。

M:DNAmarkerDL2000;1,2:pQE-80L–Mr38000；

Mr38000pQE-80L-Mr38000重组质粒BamHI和EcoRⅠ双酶切鉴定结果。

2.3pQE-80L-Mr38000在pQE-80L-Mr38000表达载体上被激活过夜，pQE-80L-Mr38000在37℃激活，通过IPTG诱导表达后对SDS-PAGE进行分析，从电泳图上可以看到一条表达带出现于Mr达38.5—103一致的位置。其中约20%的蛋白质表达(图3)。

M：蛋白质分子量marker;1：非诱导pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α；

4:pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α；

PAGE分析3(His)6-Mr38000融合蛋白。

2.4目的蛋白的鉴定构建的重组质粒表达Mr38000蛋白，其中含有6个组氨酸，用His)6mAb证实Mr38000蛋白的表达。实验结果表明，一显色带位于Mr38.5×103，而对照则没有(图4)。

M：蛋白质分子质量；1:(His)6-Mr38000proteinexpression2.DH5α。

图片4(His)6-Mr38000融合蛋白的Westernblot分析结果。

对样品进行上清液和沉淀处理，经SDS-PAGE分析表明，表达产物主要发生于细菌裂解后的沉淀，上清中表达产物较少(图5)。

M：蛋白质分子量marker;1：非诱导pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α；

2：超声裂解诱导细菌沉淀；3、诱导细菌超声裂解后上清；

图5(His)6-Mr38000融合蛋白的可溶性分析。

2.6目的蛋白纯化后，用SDS-PAGE分析可以从Mr38.5~103上获得一条清晰的条带。

M：蛋白质分子量marker;1：非诱导pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α；

2:E.coliDH5α；3,4:(His)6-Mr38000质量重组菌株。

图6(His)6-Mr38000融合蛋白的表达与纯化。

3讨论

Mr38000蛋白是一种磷酸盐转运体，包含7个位于结核分枝杆菌特异单克隆抗体的表位，具有很强的抗原性，已被结核病研究者所公认。1992年，Bothamley[4]等提出Mr38000蛋白是研究菌阴性肺结核最有用的抗原之一。通过对蛋白基因芯片及患者血清的筛选，2006年Mark[5]等检测到Mr38000蛋白为空洞性肺结核的特异蛋白抗原。

本文所用pQE-80L表达载体为4751bp，起始码下游接有6个组氨酸，是双链环状，Amp抗性，多克隆位点有17个单一酶切位。PCR共测到1150bp，与Mr38000蛋白基因大小基本一致。在pQE-80L载体中，Mr38000与6个组氨酸融合后，可以得到大约390个氨基酸的融合蛋白，其Mr38000×103左右，与理论值相符。由于融合蛋白(His)6有表达，所以Mr38000蛋白的表达可以通过检测表达来证实Mr38000蛋白的表达，同时(His)6的表达为其提供了亲和位点。其与Ni+特异性结合，利用Ni-NTA亲和柱和色谱柱可获得目的蛋白。

对Mr38000蛋白在原核表达系统中成功表达，并对Mr38000蛋白进行了初步鉴定和纯化，为进一步深入研究Mr38000蛋白奠定了基础。