造成肺结核流行的重要原因

来源:华文易迅 时间:2023-06-05 09:00:03

结核菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是肺结核(tuberculosis,TB)的一种病原。它在病人体内以细胞内生长为主。缺乏诊断手段是造成肺结核流行的重要原因。当前普遍采用的PPD试验，往往使BCG疫苗接种者呈阳性误检率[1]，而且对晚期结核病人的敏感度较低，存在明显缺陷。近几年来，Mr38000蛋白已被发现具有很强的免疫原性，并成为结核分枝杆菌抗原研究的热点[2,3]，可作为结核病血清诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。目的：将结核分枝杆菌Mr38000蛋白在原核表达载体中表达并纯化，为进一步研究该菌株的抗原性及主要功能提供了方便。

1物质与方法。

1.1材料为MTB毒株，H37Rv,DH5α，pGEM-T-Easy和WizardPlusPurificationsystem购买；X-gal，TaqDNA聚合酶和EcoRⅠ和T4-DNA连接酶，都是TaqDNA聚合酶和IPTG公司的产物。DTT、DTE、少量质粒提取测试盒为Sigma公司产品，胶体回收试剂盒采用Vitagene公司产品。

1.2方法

1.2.1引物的设计和合成是基于已发表的MTBH37Rv全基因组Mr38000蛋白质序列设计引物。上行引物P1:5'-AGGGATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3'，包含了BamHⅠ的酶切位置和开始密码子。下流引物P2:5'-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTGGCTGGGGGGGGGGGG-G-3'，下游引物为P2:5'-GATGAATTAATTCATTCGTCGCGTG-3'。所引证为上海生工生物科技有限公司。

1.2.2Mr38000片段的扩增取到了MTBH37Rv，并在7H9液体培养基中分别接种于改良罗氏培养基，并在37℃间振荡2~3wk。用5mL液体培养液，将菌体沉淀重悬于50μL裂解液(5μL,45g/L吐温，NP-405μL，水34.5μL/L,NP-405μL，水34.5μL)。将蛋白酶K在55℃的水浴1h，去沸水浴10min，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，以50μLTE溶解，作为DNA模板。PCR反应体系为：dNTPs5μL(2.5mmoL/L),DNA模板1μL,P1,P2引物各1μL(25μmoL/L)和Taq酶1μL，加水至50μL。PCR反应条件为94℃变性40s,60℃-30s,72℃延长1.5min,30周循环。

1.2.3PCR产物克隆及鉴定PCR产物琼脂糖凝胶电泳可回收条带。将PCR产物与质粒pGEM-T-Easy连接，将感受态DH5α均匀涂布于含有x-gal(33μL)和异丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG(20μL)的LB培养皿中，对培养16h后的白菌落进行酶切法鉴定，阳性细胞命名为pGEM-T-Easy-Mr38000，送交上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.4目的蛋白通过BamHI和EcoRⅠ双酶切后与pQE-80L载体进行连接反应，将其转化为DH5α，并将其分离到相同酶切的阳性克隆称为pQE-80L-Mr38000。pQE-80L-Mr38000在含有氨苄西林的LB培养基中过夜培养。以10%的接种量转接，37℃摇菌3h后，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至最终浓度0.5mmoL/L,37℃继续培养4~5h。用1.5mL细菌培养物，8000g离心30s收集菌体，加入2号样品缓冲液，使其充分混合，100℃，5min;8000g离心5min，取上清，进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.5目的蛋白的Westernblot分析了诱导的pQE-80L-Mr38000和E.coliDH5α分别制样，在获得12%的SDS-PAGE之后，在2小时的时间内以0.15mA的恒流电转到硝酸纤维素膜上，用50g/L脱脂牛奶封闭2h。经PBS洗涤，加用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:5000稀释)4℃，PBS洗涤后加入HRP标记的羊抗IgG抗体。37℃孵化1h左右。用DAB进行PBS洗涤后的显色观察。

1.2.6目的蛋白可溶性分析大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，采集细菌，超声破菌。经离心上清，沉淀分离，分离，SDS-PAGE分析。

1.2.7根据Ni-NTA试剂盒的说明，将融合蛋白与NI-NTA结合，用不同的pH值溶液洗脱，得到纯化产物。